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生命科学研究热点,基因突变的检测方法

时间:2019-03-18 17:11来源: 作者: 点击:
写在前面多聚酶链反应技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因

生命科学研究热点,基因突变的检测方法

写在前面

多聚酶链反应技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上, 下面小析姐分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

生命科学研究热点,基因突变的检测方法

基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变,只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。

多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出的新方法不断出现,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有 很 大 很 提 高 。 下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

1

PCR-SSCP 法

PCR-SSCP 法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA 和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象,一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA 在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。

用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp 时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP 会提高其录敏度。

应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法,仅检测第5-8 外显子即可发现85%以上的p53 基因突变。由于该法简便快速,特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。

2

异源双链分析法(HA)

HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分析。但HA 对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100%。

3

突变体富集PCR 法

突变体富集PCR (mutant-enriched PCR),本法的基本原理是利用ras 基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras 基因第12 密码子的BstNI位点,第13 密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR 来扩增包括K-ras第12、13 密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增,而突变型则能完整进入第二次PCR 扩增并得到产物的富集。

4

变性梯度凝胶电泳法

变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradinentelectrophoresis,DGGE),DGGE 法分析PCR产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100%,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。

由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上,又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法(温度梯度凝胶电泳temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选。

5

化学切割错配法

(责任编辑:admin)
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